yobo官网

性命迷信
化学
阐发
仪器
耗材
质谱级赖氨酰肽链内切酶
Lysyl Endopeptidase

质谱级赖氨酰肽链内切酶新品速递图wako.jpg

Lysyl Endopeptidase


2916013472337490.jpg


  本产物是质谱阐发前处置经常用的卵白分化酶即赖氨酰肽链内切酶,该酶能够特同性切除赖氨酸基团C末真个多肽,可用于卵白测序阐发和Lys-X化合物的酶分化。若同时利用赖氨酰肽链内切酶和胰酶,可更好地堵截赖氨酸 基团的多肽,增添多肽的数目。产物已按照利用习气做成小包装,是便利利用的冷冻枯燥品。20 μg/支可用于100-200个样品的凝胶内消化。


来历:细菌

表面:冻干粉(包罗2 mmol/L Tris-HCl缓冲液,pH8)

活性:0.03~0.07 AU/vial

份子量:27,000(琼脂糖过滤),30,000(SDS-PAGE)

消融性:溶于水或缓冲液

不变性:消融于pH值5.0-12.0的Tris缓冲液中,可在4℃不变保管2年;在pH值6.0-11.0 30℃时能不变保管,但温度跨越50℃时不不变。

最适pH值:9.0~9.5

等电点:6.9~7.0 

底物特同性:

可水解底物——Tos-Lys-OMe,Bz-Lys-NH2,Bz-Lys-pNA,Lys-pNA

不可水解底物——Bz-Arg-NH2,Bz-Arg-pNA,Arg-pNA

按捺剂:DFP,PMSF,TLCK



特色


●  高特同性、高卵白质消化率、合用于卵白质谱阐发

  进步裂解效力、增添肽段数目

  按照利用量特地制备小包装,便利利用



利用


  别离接纳胰卵白酶(Tp)、赖氨酰肽链内切酶 (Lys-C) 和Tp与Lys-C联用停止胶内酶切的成果比拟。

  牛血清卵白BSA 的条带(100ng) 经由过程SDS-PAGE 取得,而后别离用Tp、Lys-CLys-C+Tp停止酶切,再用MALDI-TOFMS法停止阐发。

  这些卵白酶的尝试成果见下表。


表 1:Tp、Lys-CLys-C+Tp的成果对比

这些成果标明Lys-C酶解的毛病裂解率最低。Tp酶解时插手Lys-C后,毛病裂解率有所下降,同时,能够判定出更多的多肽。



Tp 

Lys-C

Lys-C+Tp

裂解位点

精氨酸和赖氨酸的C端 

赖氨酸的C端 

精氨酸和赖氨酸的C端

毛病裂解率

(  毛病裂解所占比例  )

多(8%)

很少(0%)

少(3%) 

判定出的多肽数目 

17

19

22


blob.png


胰卵白酶 (Tp)( 图 a) 和赖氨酰肽链内切酶 (Lys-C)+Tp ( 图 b) 酶切后的质谱成果对比图。

Lys-C+Tp酶切后,能够在m/z=2000时获得接收峰,而零丁的Tp酶切在m/z=2000时不接收峰。该成果标明Lys-C能够进步测序笼盖度。

 

( 数据由大阪医疗中间和妇婴安康研讨所Y. Wada博士供给 )



赖氨酰肽链内切酶


  赖氨酰肽链内切酶,最后由Masaki 等人从泥土细菌平分手获得。该酶能够特同性剪切赖氨酸残基C 结尾和S-氨乙基半胱氨酸残基的肽键,用于卵白测序和Lys-X 化合物的酶催化分化。该酶不变性高,在4M 尿素或0.1%SDS 溶液中30℃孵育6小时以后,依然具有完全的生物活性。


表面

  冻干粉(包罗ca. 10% Tris-HCl buffer,pH 8)

活性

  见包装

份子量

  27,000(凝胶过滤);30,000 (SDS-PAGE)

消融性

  易溶于水或缓冲液

最好pH

  9.0-9.5(酰胺酶的最好活性pH)

等电点

  6.9-7.0

按捺剂

  DFP、PMSF、TLCK

来历

  细菌

不变性

 溶于pH 值5.0-12.0 的缓冲液中,可于4℃不变保管。溶于pH值6.0-11.0的缓冲液中,可于30℃稳

 定保管,可是50℃及以上不不变。

单元界说

 一单元酰胺酶(AU) 指在30℃ pH 9.5 时每分钟发生1 μmol对硝基苯胺所需的酶量。

底物特同性

 水解底物:Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

 非水解底物:Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA


尝试体例


1试剂:

A.0.2 mol/L AMP 缓冲液,pH值9.5

消融4.2g的2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇于150 mL的水中,插手1 mol/L HCl调pH值至9.5,再加水使体积至200 mL。

B.2.5 mmol/L 底物溶液

消融22.6 mg的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐于20 mL水中。

C.  2 mmol/L Tris-HCl缓冲液,pH8

消融0.24 mg的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇于900 mL水中,插手0.1 mol/L HCl调pH值至8,再加水使体积至1 L。

D. 酶溶液

消融1vial的赖氨酰肽链内切酶于1 mL的溶剂C中,可间接插手。

E.停止溶液

将55 mL水和45 mL乙酸夹杂平均。


 

2. 步骤


试剂

检测样品

空缺对比

A

2.6 mL

2.6 mL

B

0.3 mL

0.3 mL


30℃预培育5分钟

D

0.1 mL

-

C

-

0.1 mL


当即夹杂平均,30℃预培育25分钟

E

1.0 mL

1.0 mL

 

3. 单元的界说

酰胺酶单元是指30℃ pH9.5时,每分钟发生1 μmol对硝基苯胺的酶量。

 

AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)

a.    检测样品中的吸光度

b.    空缺对比中的吸光度

 

胶内酶切的尝试操纵流程

  用聚硅酮处置的微量离心管和吸管端避免捕获任何卵白。利用质谱阐发用凝胶染色试剂盒,比方银染剂MS试剂盒(产物编号:299-58901)和负凝胶染色MS试剂盒(产物编号:293-57701

1.    电泳分手卵白质样品;

2.    从凝胶中切割卵白质片断并放入微量离心管;

3.    使凝胶脱色(可利用质谱阐发用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液);

4.    插手300 μL乙腈到试管里,搅拌器振荡30分钟;

5.    去除乙腈,用Parafilm膜笼盖微量离心管。

6.    Parafilm膜上打出针孔,真空枯燥15分钟;

7.    100 μL 10 mmol/L DTT消融于100 mmol/L 56℃恒温1小时。

8.    室温冷却后,用等量的50 mM碘乙酰胺消融于100 mmol/L 暗处恒温45分钟并涡旋;

9.    用100 μL 100 mmol/L洗濯凝胶片断10分钟;

10.  用300 μL乙腈枯燥凝胶片断15分钟;

11.  用100 μL 100 mmol/L溶胀凝胶片断15分钟;

12.  300 μL乙腈再次枯燥凝胶片断15分钟;

13.  去除液相,真空枯燥凝胶片断15分钟;

14.  100 μL赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片断45分钟;

  *赖氨酸内切酶稀释于50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5

15.  去除100 μL赖氨酸内切酶溶液,将凝胶片断放在37 10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5中留宿;

16.  插手50 μL 20mmol/L20分钟内振荡凝胶片断3次抽提多肽;

17.  插手5%甲酸/50%乙腈20分钟内振荡凝胶片断3次抽提多肽;

18.  若是须要用Speed Vac.稀释多肽;

19.  ZipTip脱盐和纯化多肽;

20.  若是须要用弱真空稀释多肽至2 μL

21.  插手基质停止质谱阐发。

 

注重:按照细菌的心理和形状特点分类,产物来历为水解无色杆菌,可是比来细菌分类学将这类细菌判定为产酶溶杆菌。


保管:暗处-20℃保管

 

规格:20 μg×5 vial



相干产物


产物编号产物称号包装利用

Trypsin, from Porcine Pancreas

Mass Spectrometry Grade

猪胰腺胰卵白酶质谱级别
5×20 μg卵白质组学
Endoproteinase Asp-N, Sequencing grade
胞内卵白酶 Asp-N(测序级别)
2 μg用于测序
Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade
胞内卵白酶 Glu-C(测序级别)
50 μg
V8 Protease [Endoproteinase Glu-C]
V8卵白酶
2 mg生归天学



pdfyobo官网图.png

点击图片翻开PDF

0215252403092795.jpg

赖氨酰肽链内切酶,MS级

产物编号:125-05061

颁发文献


[1]   Ojima T et al. “Characterization of Halomonas Sp. Strain H11 {alpha}-Glucosidase Activated by Monovalent Cations and Its Application for Efficient Synthesis of {alpha}-D-Glucosylglycerol.” Applied and Environmental Microbiology 78, no. 6 (March 15, 2012): 1836–1845.


[2]   Leitner A et al. “Expanding the Chemical Cross-Linking Toolbox by the Use of Multiple Proteases and Enrichment by Size Exclusion Chromatography.”Molecular and Cellular Proteomics 11, no. 3 (March 1, 2012): M111.014126.


[3]   Goetze A et al. “Rates and Impact of Human Antibody Glycation in Vivo.” Glycobiology 22, no. 2 (February 1, 2012): 221–234.


[4]   Thingholm, T et al. “Characterization of Human Myotubes From Type 2 Diabetic and Nondiabetic Subjects Using Complementary Quantitative Mass Spectrometric Methods.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 9 (September 1, 2011): M110.006650.


[5]    Shoji M et al. “walK and clpP Mutations Confer Reduced Vancomycin Susceptibility in Staphylococcus Aureus.” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55, no. 8 (August 1, 2011): 3870–3881.


[6]    Kubota T et al. “Quantitative Proteomic Analysis of Chromatin Reveals That Ctf18 Acts in the DNA Replication Checkpoint.”Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 7 (July 1, 2011): M110.005561.


[7]   Lee E et al. “The Steady-State Repertoire of Human SCF Ubiquitin Ligase Complexes Does Not Require Ongoing Nedd8 Conjugation.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 5 (May 1, 2011): M110.006460.


[8]    Shirai Y et al. “Direct Binding of RalA to PKC{eta} and Its Crucial Role in Morphological Change During Keratinocyte Differentiation.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 8 (April 15, 2011): 1340–1352.


[9]    Liu D et al. “N-terminal Glutamate to Pyroglutamate Conversion in Vivo for Human IgG2 Antibodies.” Journal of Biological Chemistry 286, no. 13 (April 1, 2011): 11211–11217.


[10]    Shen H et al. “Constitutive Activated Cdc42-associated Kinase (Ack) Phosphorylation at Arrested Endocytic Clathrin-coated Pits  of Cells That Lack Dynamin.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 4 (February 15, 2011): 493–502.


[11]    Keinath N et al. “PAMP (Pathogen-associated Molecular Pattern)-induced Changes in Plasma Membrane Compartmentalization Reveal Novel Components of Plant Immunity.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 50 (December 10, 2010): 39140–39149.


[12]    Maeda T et al. “Purification, Characterization and Amino Acid Sequence of a Novel Enzyme, D-threo-3-hydroxyaspartate Dehydratase, from Delftia Sp. HT23.” Journal of Biochemistry 148, no. 6 (December 1, 2010): 705–712.


[13]   Rajagopal C et al. “Secretion Stimulates Intramembrane Proteolysis of a Secretory Granule Membrane Enzyme.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34632–34642.


[14]    Sato H et al.“Novel Isonitrile Hydratase Involved in Isonitrile Metabolism.”Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34793–34802.


[15]    Manno S et al. “ATP-dependent Mechanism Protects Spectrin Against Glycation in Human Erythrocytes.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 44 (October 29, 2010): 33923–33929.


[16]    Matsumoto T et al. “Proteomic Analysis Identifies Insulin-like Growth Factor-binding Protein-related Protein-1 as a Podocyte Product.” Renal Physiology 299, no. 4 (October 1, 2010): F776–784.


[17]    Sury M et al. “The SILAC Fly Allows for Accurate Protein Quantification in Vivo.” Molecular and Cellular Proteomics 9, no. 10 (October 1, 2010): 2173–2183.



产物编号 产物称号 产物规格 产物品级 产物价钱
Lysyl Endopeptidase, MS Grade 
赖氨酰肽链内切酶,MS级
20 μg×5 质谱级 -
Copyright (C) 2013-2020 baytelwatan.com. All Rights Reserved.
yobo官网:粤ICP备14096942号