质谱级赖氨酰肽链内切酶
Lysyl Endopeptidase
本产物是质谱阐发前处置经常用的卵白分化酶即赖氨酰肽链内切酶，该酶能够特同性切除赖氨酸基团C末真个多肽，可用于卵白测序阐发和Lys-X化合物的酶分化。若同时利用赖氨酰肽链内切酶和胰酶，可更好地堵截赖氨酸 基团的多肽，增添多肽的数目。产物已按照利用习气做成小包装，是便利利用的冷冻枯燥品。20 μg/支可用于100-200个样品的凝胶内消化。
来历：细菌
表面：冻干粉（包罗2 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8）
活性：0.03～0.07 AU/vial
份子量：27,000(琼脂糖过滤)，30,000（SDS-PAGE）
消融性：溶于水或缓冲液
不变性：消融于pH值5.0-12.0的Tris缓冲液中，可在4℃不变保管2年；在pH值6.0-11.0 30℃时能不变保管，但温度跨越50℃时不不变。
最适pH值：9.0~9.5
等电点：6.9~7.0
底物特同性：
可水解底物——Tos-Lys-OMe,Bz-Lys-NH2,Bz-Lys-pNA,Lys-pNA
不可水解底物——Bz-Arg-NH2,Bz-Arg-pNA,Arg-pNA
按捺剂：DFP，PMSF，TLCK
◆特色
● 高特同性、高卵白质消化率、合用于卵白质谱阐发
● 进步裂解效力、增添肽段数目
● 按照利用量特地制备小包装，便利利用
◆利用
别离接纳胰卵白酶(Tp)、赖氨酰肽链内切酶 (Lys-C) 和Tp与Lys-C联用停止胶内酶切的成果比拟。
牛血清卵白BSA 的条带(100ng) 经由过程SDS-PAGE 取得，而后别离用Tp、Lys-C和Lys-C+Tp停止酶切，再用MALDI-TOFMS法停止阐发。
这些卵白酶的尝试成果见下表。
表 1：Tp、Lys-C和Lys-C+Tp的成果对比
这些成果标明Lys-C酶解的毛病裂解率最低。Tp酶解时插手Lys-C后，毛病裂解率有所下降，同时，能够判定出更多的多肽。
Tp | Lys-C | Lys-C+Tp | |
裂解位点 | 精氨酸和赖氨酸的C端 | 赖氨酸的C端 | 精氨酸和赖氨酸的C端 |
毛病裂解率 ( 毛病裂解所占比例 ) | 多(8%) | 很少(0%) | 少(3%) |
判定出的多肽数目 | 17 | 19 | 22 |
胰卵白酶 (Tp)( 图 a) 和赖氨酰肽链内切酶 (Lys-C)+Tp ( 图 b) 酶切后的质谱成果对比图。
Lys-C+Tp酶切后，能够在m/z=2000时获得接收峰，而零丁的Tp酶切在m/z=2000时不接收峰。该成果标明Lys-C能够进步测序笼盖度。
( 数据由大阪医疗中间和妇婴安康研讨所Y. Wada博士供给 )
赖氨酰肽链内切酶
赖氨酰肽链内切酶，最后由Masaki 等人从泥土细菌平分手获得。该酶能够特同性剪切赖氨酸残基C 结尾和S-氨乙基半胱氨酸残基的肽键，用于卵白测序和Lys-X 化合物的酶催化分化。该酶不变性高，在4M 尿素或0.1%SDS 溶液中30℃孵育6小时以后，依然具有完全的生物活性。
表面 | 冻干粉（包罗ca. 10% Tris-HCl buffer，pH 8） | 活性 | 见包装 |
份子量 | 27,000（凝胶过滤）；30,000 (SDS-PAGE) | 消融性 | 易溶于水或缓冲液 |
最好pH | 9.0-9.5（酰胺酶的最好活性pH） | 等电点 | 6.9-7.0 |
按捺剂 | DFP、PMSF、TLCK | 来历 | 细菌 |
不变性 | 溶于pH 值5.0-12.0 的缓冲液中，可于4℃不变保管。溶于pH值6.0-11.0的缓冲液中，可于30℃稳 定保管，可是50℃及以上不不变。 | ||
单元界说 | 一单元酰胺酶(AU) 指在30℃ pH 9.5 时每分钟发生1 μmol对硝基苯胺所需的酶量。 | ||
底物特同性 | 水解底物：Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA | ||
非水解底物：Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA | |||
尝试体例
1. 试剂：
A．0.2 mol/L AMP 缓冲液，pH值9.5
消融4.2g的2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇于150 mL的水中，插手1 mol/L HCl调pH值至9.5，再加水使体积至200 mL。
B．2.5 mmol/L 底物溶液
消融22.6 mg的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺盐酸盐于20 mL水中。
C. 2 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8
消融0.24 mg的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇于900 mL水中，插手0.1 mol/L HCl调pH值至8，再加水使体积至1 L。
D. 酶溶液
消融1vial的赖氨酰肽链内切酶于1 mL的溶剂C中，可间接插手。
E．停止溶液
将55 mL水和45 mL乙酸夹杂平均。
2. 步骤
试剂 | 检测样品 | 空缺对比 |
A | 2.6 mL | 2.6 mL |
B | 0.3 mL | 0.3 mL |
30℃预培育5分钟 | ||
D | 0.1 mL | - |
C | - | 0.1 mL |
当即夹杂平均，30℃预培育25分钟 | ||
E | 1.0 mL | 1.0 mL |
3. 单元的界说
酰胺酶单元是指30℃ pH9.5时，每分钟发生1 μmol对硝基苯胺的酶量。
AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)
a. 检测样品中的吸光度
b. 空缺对比中的吸光度
胶内酶切的尝试操纵流程
用聚硅酮处置的微量离心管和吸管端避免捕获任何卵白。利用质谱阐发用凝胶染色试剂盒，比方银染剂MS试剂盒（产物编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产物编号：293-57701）
1. 电泳分手卵白质样品；
2. 从凝胶中切割卵白质片断并放入微量离心管；
3. 使凝胶脱色（可利用质谱阐发用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液）；
4. 插手300 μL乙腈到试管里，搅拌器振荡30分钟；
5. 去除乙腈，用Parafilm膜笼盖微量离心管。
6. 在Parafilm膜上打出针孔，真空枯燥15分钟；
7. 100 μL 10 mmol/L DTT消融于100 mmol/L ，56℃恒温1小时。
8. 室温冷却后，用等量的50 mM碘乙酰胺消融于100 mmol/L ，暗处恒温45分钟并涡旋；
9. 用100 μL 100 mmol/L洗濯凝胶片断10分钟；
10. 用300 μL乙腈枯燥凝胶片断15分钟；
11. 用100 μL 100 mmol/L溶胀凝胶片断15分钟；
12. 用300 μL乙腈再次枯燥凝胶片断15分钟；
13. 去除液相，真空枯燥凝胶片断15分钟；
14. 用100 μL赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片断45分钟；
*赖氨酸内切酶稀释于50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5；
15. 去除100 μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片断放在37℃ 10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5中留宿；
16. 插手50 μL 20mmol/L20分钟内振荡凝胶片断3次抽提多肽；
17. 插手5%甲酸/50%乙腈20分钟内振荡凝胶片断3次抽提多肽；
18. 若是须要用Speed Vac.稀释多肽；
19. 用ZipTip脱盐和纯化多肽；
20. 若是须要用弱真空稀释多肽至2 μL；
21. 插手基质停止质谱阐发。
注重：按照细菌的心理和形状特点分类，产物来历为水解无色杆菌，可是比来细菌分类学将这类细菌判定为产酶溶杆菌。
保管：暗处-20℃保管
规格：20 μg×5 vial
相干产物
| 产物编号 | 产物称号 | 包装 | 利用 |
Trypsin, from Porcine Pancreas, Mass Spectrometry Grade 猪胰腺胰卵白酶质谱级别 | 5×20 μg | 卵白质组学 | |
| Endoproteinase Asp-N, Sequencing grade 胞内卵白酶 Asp-N（测序级别） | 2 μg | 用于测序 | |
| Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade 胞内卵白酶 Glu-C（测序级别） | 50 μg | ||
| V8 Protease [Endoproteinase Glu-C] V8卵白酶 | 2 mg | 生归天学 |
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[1] Ojima T et al. “Characterization of Halomonas Sp. Strain H11 {alpha}-Glucosidase Activated by Monovalent Cations and Its Application for Efficient Synthesis of {alpha}-D-Glucosylglycerol.” Applied and Environmental Microbiology 78, no. 6 (March 15, 2012): 1836–1845.
[2] Leitner A et al. “Expanding the Chemical Cross-Linking Toolbox by the Use of Multiple Proteases and Enrichment by Size Exclusion Chromatography.”Molecular and Cellular Proteomics 11, no. 3 (March 1, 2012): M111.014126.
[3] Goetze A et al. “Rates and Impact of Human Antibody Glycation in Vivo.” Glycobiology 22, no. 2 (February 1, 2012): 221–234.
[4] Thingholm, T et al. “Characterization of Human Myotubes From Type 2 Diabetic and Nondiabetic Subjects Using Complementary Quantitative Mass Spectrometric Methods.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 9 (September 1, 2011): M110.006650.
[5] Shoji M et al. “walK and clpP Mutations Confer Reduced Vancomycin Susceptibility in Staphylococcus Aureus.” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55, no. 8 (August 1, 2011): 3870–3881.
[6] Kubota T et al. “Quantitative Proteomic Analysis of Chromatin Reveals That Ctf18 Acts in the DNA Replication Checkpoint.”Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 7 (July 1, 2011): M110.005561.
[7] Lee E et al. “The Steady-State Repertoire of Human SCF Ubiquitin Ligase Complexes Does Not Require Ongoing Nedd8 Conjugation.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 5 (May 1, 2011): M110.006460.
[8] Shirai Y et al. “Direct Binding of RalA to PKC{eta} and Its Crucial Role in Morphological Change During Keratinocyte Differentiation.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 8 (April 15, 2011): 1340–1352.
[9] Liu D et al. “N-terminal Glutamate to Pyroglutamate Conversion in Vivo for Human IgG2 Antibodies.” Journal of Biological Chemistry 286, no. 13 (April 1, 2011): 11211–11217.
[10] Shen H et al. “Constitutive Activated Cdc42-associated Kinase (Ack) Phosphorylation at Arrested Endocytic Clathrin-coated Pits of Cells That Lack Dynamin.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 4 (February 15, 2011): 493–502.
[11] Keinath N et al. “PAMP (Pathogen-associated Molecular Pattern)-induced Changes in Plasma Membrane Compartmentalization Reveal Novel Components of Plant Immunity.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 50 (December 10, 2010): 39140–39149.
[12] Maeda T et al. “Purification, Characterization and Amino Acid Sequence of a Novel Enzyme, D-threo-3-hydroxyaspartate Dehydratase, from Delftia Sp. HT23.” Journal of Biochemistry 148, no. 6 (December 1, 2010): 705–712.
[13] Rajagopal C et al. “Secretion Stimulates Intramembrane Proteolysis of a Secretory Granule Membrane Enzyme.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34632–34642.
[14] Sato H et al.“Novel Isonitrile Hydratase Involved in Isonitrile Metabolism.”Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34793–34802.
[15] Manno S et al. “ATP-dependent Mechanism Protects Spectrin Against Glycation in Human Erythrocytes.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 44 (October 29, 2010): 33923–33929.
[16] Matsumoto T et al. “Proteomic Analysis Identifies Insulin-like Growth Factor-binding Protein-related Protein-1 as a Podocyte Product.” Renal Physiology 299, no. 4 (October 1, 2010): F776–784.
[17] Sury M et al. “The SILAC Fly Allows for Accurate Protein Quantification in Vivo.” Molecular and Cellular Proteomics 9, no. 10 (October 1, 2010): 2173–2183.
| 产物编号 | 产物称号 | 产物规格 | 产物品级 | 产物价钱 |
| Lysyl Endopeptidase, MS Grade 赖氨酰肽链内切酶，MS级 |
20 μg×5 | 质谱级 | - |
